Угарова Н.Н.
Кафедра химической энзимологии

Новый этап в изучении люцифераз светляков начался в середине 90-х годов, когда стала известна пространственная структура люциферазы светляковPhotinus pyralis. Изучаемая в нашей лаборатории люцифераза светляков Luciola mingrelica имеет гомологию с люциферазой P. рyralis 67 %. Тем не менее проведенное нами компьютерное моделирование показало, что пространственные структуры обоих ферментов не имеют существенных различий. Структура люциферазы P. рyralis была получена для свободного фермента, поэтому строение активного центра люциферазы оставалось неизвестным. Используя данные о пространственной структуре люциферазы и фермент-субстратного комплекса другого фермента, выполняющего на первой стадии ферментативного процесса (аденилирование субстрата с помощью АТФ) ту же функцию, что и люцифераза светляков, мы построили компьютерную модель комплекса люцифераза-люциферин-АТФ. Правильность нашей модели структуры активного центра фермента была подтверждена методом мутагенеза. Знание структуры активного центра позволило подтвердить ранее выдвинутые нами гипотезы о гидрофильной природе окружения субстратов в активном центре фермента и объяснить практически абсолютную специфичность люциферазы по отношению к ее субстратам.

Люциферазы из различных светляков и их мутантные формы генерируют биолюминесценцию с максимумами от 548 до 620 нм. Анализ пространственных структур нативных и мутантных люцифераз показал, что это связано с заменами отдельных ключевых аминокислотных остатков, локализованных вне активного центра. Мы предложили физико-химический механизм, регулирующий взаимосвязь между максимумом биолюминесценции и поляризуемостью активного центра люциферазы. Поляризуемость может увеличиваться (или уменьшаться) в результате замен аминокислотных остатков, удаленных от активного центра и тем самым приводить к сдвигу спектра биолюминесценции в красную или голубую область спектра. На основании этих представлений методом направленного мутагенеза мы получили ряд мутантов по остатку Гис433. Замена Гис433Тир позволила получить высокоактивный фермент с максимумом биолюминесценции, сдвинутым в красную область на 40 нм.

Одним из важных достижений нашей лаборатории последних лет была разработка технологии получения высокоочищенной рекомбинантной люциферазы светляков и АТФ-реагентов - лиофилизованных препаратов, которые включают все необходимые компоненты для измерения АТФ (люцифераза, люциферин, компоненты буферного раствора и стабилизаторы). АТФ содержится во всех живых клетках. Чувствительность биолюминесцентной детекции клеток по содержанию внутриклеточного АТФ составляет менее тысячи клеток в 1 мл образца. Измерение АТФ занимает 1-2 мин, а полный анализ образца, в зависимости от сложности пробоподготовки, требует не более 6 часов. Именно поэтому метод биолюминесцентной АТФ-метрии стал основой так называемой "быстрой микробиологии",которая по сравнению с традиционным микробиологическим методом позволяет не только значительно сократить длительность анализа, но и уменьшить его трудоемкость и стоимость. Нами разработаныоригинальные методики биолюминесцентного микроанализа для медицины, экологии, пищевой промышленности и сельского хозяйства, для технологии и биотехнологии. Многие из них прошли успешную апробацию и получили положительные отзывы потребителей.