Проникновение биокатализа в химическую индустрию

В последние годы в связи с интенсивным развитием биотехнологии и промышленной микробиологии наметились две основные тенденции использования биокатализа для нужд химической промышленности. Во-первых, значительно возрос интерес к альтернативным процессам получения химических соединений, в том числе крупнотоннажных продуктов тяжелого органического синтеза. По некоторым прогнозам 10-20% промышленных химикатов скоро будет производиться биотехнологическим путем, среди них особенно интересны с точки зрения химика продукты прямого селективного окисления предельных и непредельных углеводородов в ценные окси-продукты: хиральные эпоксиды, спирты, метилкетоны, дикарбоновые кислоты. Во-вторых, пристальное внимание уделяется разработке гибридных процессов, в которых одной из ключевых стадий является биохимическая конверсия субстрата, а также модернизации традиционных химических производств введением в производственный процесс биокаталитической стадии с участием ферментов или бактериальных клеток.

Альтернативные процессы. Одно ведущих мест в промышленном освоении биокаталитических процессов занимают процессы окислительной биотрансформации органических соединений, в том числе, углеводородного сырья. Интересно, что целенаправленные и относительно дорогостоящиее исследования в этой области проводят крупные химические компании и концерны Японии (Nippon Mining Co., Nitto Chem. Ind.), Америки (EXXON, DOW Chem., MONSANTO, DU PONT) и Западной Европы (HOECHST, BAYER, BASF). Наиболее яркий пример альтернативного процесса - производство оптических изомеров эпоксидов непредельных углеводородов (описаны свойства 31 эпоксида), которые, как известно, применяются в тонком органическом синтезе при производстве биологически активных веществ, а также жидких кристаллов для электроники. Данный процесс реализован японской фирмой Nippon Mining в полупромышленном масштабе с участием суспензионных культур микроорганизмов рода Nocardia. При этом выход (R)-изомеров 1,2-эпоксидов умеренной длины составляет 80% при оптической чистоте 80-90%.

Процессы селективного окисления легких газообразных углеводородов в ценные окси-продукты являются ключевыми для химических производств переработки газа и нефти. Некоторые из этих процессов, а именно, прямое селективное эпоксидирование этилена, реализованы в промышленном масштабе, другие, например, прямое парциальное окисление газообразных алканов (метана, этана, пропана) находятся в стадии интенсивных лабораторных исследований. Анализ литературных данных и многочисленных сообщений на международных конференциях и симпозиумах по селективному окислению С₁-С₄-углеводородов показывает, что широко используемые в данных процессах гетерогенные катализаторы оксидной природы обладают достаточно ограниченными возможностями: максимальная селективность по желаемому продукту, равная 80-95%, достигается только при малых степенях превращения исходного углеводорода, не превышающих 5%. Более высокие результаты по селективности (до 70%) при конверсии более 5% достигаются либо при участии закиси азота в качестве окислителя, либо при использовании для приготовления катализаторов драгоценных металлов (золота, паладия, рутения).

Использование биокатализа и биотехнологии для производства химикатов - нетрадиционный подход к решению проблем основного органического синтеза. Биокаталитические процессы привлекают внимание своими уникальными характеристиками: малой энергоемкостью вследствие мягких условий протекания реакций (температуры не выше 40^оС); высокой селективностью, близкой к 100%, которая, что очень важно, не зависит от степени превращения исходного субстрата; а также стереоспецифичностью, заключающейся в образовании хиральных соединений (Таблицы 1 и 2 демонстрируют возможности биокатализа на примерах реакций эпоксидирования пропилена и гидроксилирования метана кислородом газовой фазы). Кроме того, из-за отсутствия токсичных побочных продуктов биокаталитические процессы относятся к экологически чистым и безопасным для окружающей среды. Из Таблиц 1 и 2 видно, что по основным параметрам (активность, выход) биокатализаторы находятся на уровне лучших гетерогенных катализаторов химический природы. Единственным существенным недостатком биотехнологичеких процессов является низкая концентрация в реакционной, как правило, водной среде конечного продукта, не превышающая десятков мМ, в связи с чем возникают проблемы выделения продукта из разбавленных смесей (аналогичные проблемы возникают и в случае гетерогенного катализа при малых степенях превращений исходного вещества). Как и в случае химического процесса, данные проблемы решаются путем оптимизации процесса в целом, например, в результате подбора подходящего по конструкции реактора.

Очевидно, что первая стадия разработки любого биотехнологического процесса заключается в поиске (скрининге) микроорганизмов, обладающих необходимой биокаталитической активностью. Парциальное окисление С₁-С₄ алканов и алкенов осуществляют преимущественно газо-ассимилирующие микроорганизмы, которые растут и размножаются на газообразных углеводородах. Микроорганизмы, использующие для своего роста более тяжелые С₅-С₁₈ углеводороды, газообразные алканы и алкены не окисляют. Первая газо-ассимилирующая бактерия, использующая для роста метан в качестве единственного источника углерода, была выделена в чистом виде сравнительно недавно, в 1906 году. В настоящее время появилась глубокая убежденность, что микроорганизмы, способные ассимилировать такие инертные с химической точки зрения соединения, как насыщенные газообразные углеводороды, широко распространены в природе. Выделено уже около 200 штаммов метан-ассимилирующих бактерий (метанотрофов) из мест их обитания: пресных и соленых водоемов, болот, почв, угольных шахт, и даже из рубца жвачных животных. Другие почвенные микроорганизмы рода Rhodococcus (родококки) утилизирут пропан и бутан в качестве единственного источника углерода для роста и размножения. Экология и геохимическая деятельность этих уникальных бактерий исследуются для создания микробиологических тестов при поиске месторождений нефти и газа. Известны также алкен-ассимилирующие микроорганизмы из рода Mycobacterium (микобактерий), растущие на газообразных алкенах (этилене, пропилене, бутилене, бутадиене).

Реакции микробиологической трансформации углеводородов осуществляются ферментативными оксигеназными комплексами (монооксигеназами), о строении которых и их функциональной роли в клеточном метаболизме имеется обширная литература. Синтез монооксигеназы у газо-ассимилирующих бактерий, за исключением метанотрофов, индуцируется в присутствии углеводорода в процессе роста клеток. Клетки, выращенные на глюкозе, как правило, такой активностью не обладают и не способны трансформировать углеводороды. В зависимости от ростового субстрата (алкан или алкен) в клетке индуцируются и синтезируются различные по свойствам ферментативные комплексы - алкан-монооксигеназа или алкен-монооксигеназа, ответственные за первичную активацию молекулы углеводорода. Алкан-монооксигеназа обладает широкой субстратной специфичностью: гидроксилирует алканы и эпоксидирует алкены, в то время как алкен-монооксигеназа способна только эпоксидировать алкены. Интересно, что эти две ферментные системы (или клетки микроорганизмов с индуцированной ферментативной активностью) отличаются друг от друга также стереоспецифичностью биокатализа: метан- и алкан-монооксигеназы при эпоксидировании С₃-С₄ алкенов, образуют, как правило, рацемическую смесь оптических изомеров эпоксидов, в то время как алкен-монооксигеназы образуют в избытке (на 80-90%) энантиомерные формы, при этом в обоих случаях cys-,trans-конфигурация алкена сохраняется. Исключительными характеристиками обладает японский штамм Nocardia corallina B-276: независимо от ростового субстрата (глюкоза, алканы, алкены) клетки этого микроорганизма образуют в избытке один из оптических изомеров эпоксида. Интересно также, что в реакциях окислительной биотрансформации алкенов отсутвует какая-либо взаимосвязь между химический реактивностью окисляемых связей и окислительной активностью микроорганизмов. Например, 2-октен не эпоксидируется псевдомонадами Pseudomonas oleovorans, тогда как 1-октен окисляется с образованием 1,2-эпоксиоктана; пропилен также не эпоксидируется, а трансформируется в аллиловый спирт.

Микробиальное эпоксидирование олефинов было впервые продемонстрировано Linden A.C.van der в 1963 году, когда ему удалось с помощью клеток псевдомонад Pseudomonas aeruginosa, выращенных на гептане, получить 1 мг 1,2-эпоксиоктана из 1-октена. В последнее десятилетие исследования в этой области проводят научные коллективы разных стран (Таблица 3).

Эпоксиды, образовавшиеся в процессе микробиальной окислительной биотрансформации неростового углеводорода, накапливаются (аккумулируются) внеклеточно в реакционной среде. Поскольку данные соединения способны алкилировать белковые молекулы и разрушать клеточные мембраны, то они обладают ярко выраженным токсическим действием (эта способность позволяет использовать их в качестве стерилизующих агентов в медицинской практике, причем наиболее токсичен этиленоксид). Микроорганизмы различаются по устойчивости к действию эпоксидов: наиболее устойчивы алкен-утилизирующие микроорганизмы рода Mycobacterium (выдерживают концентрацию до 100мМ); самыми чувствительными являются метанотрофы (концентрация эпоксида в среде, обладающая выраженным токсическим действием, не превышает 10мМ).

При практической реализации биокаталитического процесса эпоксидирования алкенов необходимо решить не только проблемы выделения и концентрирования ценного окси-продукта из реакционной среды, но и максимально уменьшить токсическое действие образовавшегося эпоксида. Удаление эпоксида из зоны реакции осуществляют либо путем использования двухфазных систем "вода-несмешивающийся органический растворитель" (как правило, н-гексадекан), обеспечивающий экстракцию эпоксида в фазу растворителя, либо удаление эпоксида из газового потока путем его вымораживания или абсорбции в подходящей органической фазе (ди-н-октилфталате). Для успешного решения этих проблем используют также иммобилизацию клеток на/в твердых носителях, в результате которой, как правило, повышается устойчивость микроорганизмов к воздействию токсических веществ и органических растворителей.

Иммобилизация клеток газо-утилизирующих микроорганизмов осуществляется, в основном, путем включения в природные органические гели, в матрице которых клетки практически полностью сохраняют свою интактность (целостность, метаболическую активность) и обладают достаточно высокой трансформирующей активностью и стабильностью (Таблица 4). Основной недостаток органических гелей - большое гидродинамические сопротивление потоку вследствие их набухаемости, а также разрушение в процессе эксплуатации под действием химических и биологических факторов. Другим методом иммобилизации бактериальных клеток является адсорбция (адгезия) на поверхности неорганических носителей, при этом, как правило, происходит образование биопленок (Таблица 4). Ковалентная иммобилизация клеток используется редко, так как сшивающие агенты, применяемые для образования ковалентных связей (диальдегиды, карбодиимиды), как правило, токсичны для клеток. В настоящее время исследования по разработке новых методов иммобилизации бактериальных клеток продолжаются.

Следует еще раз отметить, что газо-ассимилирующие микроорганизмы родов Mycobacteria и Nocardia способны эпоксидировать непредельные углеводороды стереспецифично с образованием в избытке одного из оптических изомеров, который аккумулируется внеклеточно в реакционной среде. Существует также другой способ получения оптических изомеров эпоксидов, который состоит в том, что определенные микроорганизмы родов Xantobacter и Nocardia способны подвергать деградации (утилизировать) только один из стереизомеров рацемической смеси в то время, как другой изомер эпоксида алкена накапливается в среде.

Как уже отмечалось выше, проблема прямого селективного окисления алканов - основная в химии переработки природного газа, и исследования в этой области проводятся весьма интенсивно. Традиционно окисление парафинов в продукты парциального окисления проводится на катализаторах оксидной природы (например, на основе V₂O₅ или МoO₃). Гидроксилирование алканов кислородом воздуха осуществляют и некоторые газо-ассимилирующие микроорганизмы (Таблица 5). При осуществлении процессов микробиального гидроксилирования алканов возникают некоторые дополнительные проблемы (по сравнению с микробиальным эпоксидированием олефинов). Одной из таких проблем является эффективное ингибирование процесса дальнейшей биоконверсии образовавшегося в реакции спирта (схема к Таблице 5). Дело в том, что при росте микроорганизмов на насыщенных углеводородах в результате первичной активации СН-связи углеводорода бактериальной монооксигеназой образуются молекулы первичного или вторичного спирта, которые под действием фермента алкогольдегидрогеназы превращаются в альдегид или метилкетон, соответственно. При этом молекулы альдегида подвергаются дальнейшим метаболическим превращениям для включения углерода в биомассу, в то время, как метилкетоны накапливаются в реакционной среде (схема к Таблице 5). Проблема поиска эффективного универсального ингибитора микробиальной алкогольдегидрогеназы, прерывающего клеточный метаболизм на стадии образования первичного или вторичного спорта, до сих пор не решена, и, по-видимому, эту проблему следует решать индивидуально для каждого конкретного микроорганизма и процесса.

Следует отметить, что на сегодняшний момент еще рано говорить об эффективной замене тяжелого органического синтеза в промышленности альтернативными биокаталитическими процессами, однако научные исследования в этой области, лежащей на стыке микробиологии и химического катализа, несомненно актуальны и перспективны.

Гибридные процессы. Как отмечалось выше, гибридный процесс представляет собой многостадийный синтез конечного коммерческого продукта, при этом одна из стадий получения промежуточного вещества, требующая регио- или стерео-селективности, осуществляется биокатализаторами - ферментами или микроорганизмами, обладающими необходимой ферментативной активностью.

Наиболее характерным примером "гибридного" производства является процесс получение L-аспарагиновой кислоты, разработанный химической корпорацией Японии Mitsubishi Chem. Благодаря деградируемости в природных условиях, производные и полимеры, полученные на основе данной аминокислоты, имеют высокий коммерческий потенциал и находят применение как детергенты, хелатирующие агенты, абсорбенты.

На первой (химической) стадии малеиновая кислота изомеризуется в фумаровую под действием катализатора кислотного действия. Следующая стадия, на которой в присутствии аммиака, образуется L-аспарагиновая кислота, является биокаталитической, и осуществляется ферментом аспартазой, который катализирует присоединение аммиака по двойной связи фумаровой кислоты. Поскольку аспартаза является внутриклеточным ферментом, то требуется сложная и многостадийная процедура ее выделения из бактериальных клеток. Коммерческий препарат аспартазы имеет очень высокую стоимость, что делает экономически нецелесообразным использование индивидуального фермента как биокатализатора. Кроме того, выделенный фермент обладает относительно низкой стабильностью. Поэтому при разработке биокаталитической стадии гибридного процесса производства L-аспарагиновой кислоты внимание исследователей сосредоточено на поиске и использовании целых бактериальных клеток, обладающих аспартазной активностью. В гибридном процессе Mitsubishi Chem. биокаталитическая стадия осуществляется при участии суспендированных рекомбинантных клеток Coryneform MJ-233, обладающих высокой аспартазной активностью, стабильной в течение нескольких месяцев. Процесс осуществляется в периодическом режиме, бактериальные клетки удаляются из реакционной среды путем ультрафильтрации. Кристаллизация L-аспарагиновой кислоты происходит с высоким выходом, конечный продукт обладает высокой степенью чистоты. Процесс реализован в пилотной установке объемом 1 м³, его производительность достигает несколько тысяч тонн в год.

В настоящее время исследования по разработке гибридных процессов и модернизации традиционных химических производств развиваются очень интенсивно, так как данные процессы позволяют сочетать в себе преимущества химического производства с уникальными свойствами биокатализа.