ChemNet
 
Химический факультет МГУ

Спектроскопия и химия единичных молекул

Введение

Конец ХХ века (и второго тысячелетия) химия отметила сразу двумя замечательными результатами крупного, стратегического значения.

Во-первых, осуществилось желание химиков видеть, визуализировать главное событие - химическую реакцию, и представить "развёртку" этого события во времени (фемтохимия, о которой уже говорилось ранее).

Во-вторых, химия вышла на необыкновенный рубеж - детектирование единичной молекулы и её физического и химического поведения. Химия достигла такого совершенства, когда её главный предмет - молекула приобрела индивидуальность, стала "личностью". Оба результата символизируют высшие горизонты современной химии - предельное разрешение во времени и в пространстве.

Лекция 1. Оптическое детектирование одиночных молекул

Прогресс в технике фотодетекторов и сканирующих оптических микроскопов открыл доступ к наблюдению одиночных молекул (типа родамина-6Ж и террилендиимина). Возбуждая постоянным облучением и наблюдая во времени стационарную люминесценцию одиночных молекул (молекулярных "светлячков"), можно исследовать латеральную диффузию молекул на твёрдых поверхностях и объёмную диффузию в твёрдых телах (типа полимеров). Используя поляризованный свет для возбуждения и детектируя поляризованную люминесценцию, можно измерять реориентацию молекул и осуществлять мониторинг их траекторий. Уже обнаружены первые удивительные явления. Так, оказалось, что молекулы родамина-6Ж на стекле ведут себя причудливым образом: некоторые из них неподвижны, другие перемещаются не вращаясь, третьи вращаются не перемещаясь. Ещё интереснее поведение террилендиимина на поверхности SiO2: люминесценция некоторых молекул оказалась дважды модулированной низкой частотой (10Гц и 100 Гц), причём у "модулированных" молекул полосы люминесценции имеют голубой сдвиг. Ясно, что зондирование поверхностей молекулярными "светлячками" обещает много новых открытий.

Возможности оптики одиночных молекул не ограничиваются только молекулярной динамикой. Обнаруживается "мерцающее", нестатистическое поведение одиночных молекул, связанное со спектральной диффузией; возможно также прямое измерение скорости передачи энергии на соседние молекулы и зависимости её от расстояния (которое регулируется путём изменения числа "светлячков" на единицу поверхности; обычно размещается несколько молекул на квадратный микрон).

Ещё более продвинутая техника использовалась для наблюдения за флуоресценцией одиночных липидных молекул и их движением в мембране. Достоинство этой техники в том, что метка-флюорофор возбуждалась двухфотонным поглощением инфракрасного излучения фемтосекундного лазера; это резко снизило шумовой оптический фон в видимой области флуоресценции и повысило чувствительность техники; а это открыло новые горизонты в исследовании клеточных мембран на уровне единичных молекул.

Спектроскопия одиночных молекул активно вторгается в исследования единичного фотосинтезирующего комплекса и ансамбля пигментов - светособирающей антенны; она позволяет визуализировать взаимодействие между единичной фаговой ДНК и липосомой. Она информирует, на каком пигменте "cидит" энергия, с какой вероятностью она передаётся, как расположены пигменты и т.д.

Возможности оптики одиночных молекул масштабно расширяет импульсная оптическая спектроскопия. Она позволяет одновременно регистрировать интенсивность флуоресценции, поляризацию и время жизни, частоту вращения молекул и анизотропию вращательной диффузии; она использована уже для молекул с низким молекулярным весом в жидкостях и для макромолекул (включая Зелёный флуоресцирующий протеин, который сейчас привлекает широкое внимание в молекулярной биологии как клеточная молекула-репортёр).

Импульсная спектроскопия предлагает новые возможности в исследовании эргодичности в прямом измерении квантового выхода распада единичных молекул. Например, для единичных молекул тетраметилродамина, присоединённых химически к участку 217-вр ДНК, были измерены "возраст смерти" (число фотонов, излучённых молекулой до момента её гибели) и время выживания (время, которое единичная, избранная молекула живёт и излучает). Гистограммы "возраста смерти" и времени выживания, построенные для 102 молекул (каждая из них наблюдалась изолированно, в одиночестве), описывается экспоненциальной функцией. Именно на этом пути лежит экспериментальное тестирование проблемы эргодичности.

Лекция 2.Колебательная спектроскопия и химия одиночных молекул

Открытие туннельной колебательной спектроскопии одиночных молекул - новый гигантский прорыв в химии; оно трансформировало классическую туннельную микроскопию как "топографический" метод мониторинга атомно-молекулярного рельефа поверхности в мощный метод химической физики, который делает доступным детектирование спектроскопического "изображения" единичной молекулы, позволяет видеть эту молекулу, измерить частоты колебаний её атомов, следить за её физической и химической судьбой. Это открытие нового мира в химии - мира отдельных, индивидуальных молекул, не связанных "узами коллективизма".

Физическая идея спектроскопии одиночных молекул изумительно проста; туннелирующие электроны, эмитируемые иглой туннельного микроскопа, заперты в пространстве между иглой и молекулой, сидящей на поверхности под иглой (рис.1).

pic1s.gif (1609 bytes)

Движение электронов в этом пространстве (полости) ограничено двумя энергетическими барьерами: один из них создаётся иглой, другой - молекулой. При обычных условиях (плотность туннельного тока ~ 1011 электронов/A2) время пребывания электрона в полости ~10-12 - 10-13c, так что полость функционирует как наномасштабный резонатор, в котором формируются электронные волны; их частоты зависят от потенциала иглы. Если частота нанорезонатора совпадает с частотой колебательного перехода в молекуле, нижний энергетический барьер становится прозрачным для туннелирующих электронов, так что туннельный ток, который течёт между иглой и поверхностью, как функция потенциала имеет чётко выраженный резонансный характер (рис.1): каждый "всплеск" туннельного тока "метит" колебательную частоту молекулы; совокупность их есть колебательный спектр одной молекулы, её спектроскопический "портрет".

Примеры колебательных спектров единичных молекул показаны на рис.2.

pic2s.gif (2201 bytes)

Из них можно извлекать частоты колебаний атомов в единичной молекуле, "видеть" момент химического превращения молекулы, измерять время оседлой жизни молекулы и т.д.

Остановив потенциал иглы на избранном колебании, можно осуществлять энергетическую накачку этого колебания и стимулировать химическое превращение молекулы, селективное по избранной химической связи. Это можно сделать, приблизив иглу к молекуле, т.е. уменьшив размер нанореактора и увеличив туннельный ток. Фактически это новая версия селективной, настроенной на распад заданной связи, фотохимии; но это фотохимия без света, это "темновая" фотохимия. Роль световых квантов играют туннелирующие электроны, селективно активирующие заданную химическую связь.

Уже разработана техника детектирования единичного парамагнитного центра; пример спектра парамагнитного иона О2- на титане показан на рис.3.

pic3s.gif (2185 bytes)

Особенность туннельной колебательной спектроскопии единичного спина (или его носителя) - расщепление каждой линии колебательного спектра на две линии за счёт обменного взаимодействия двух электронов - туннелирующего и неспаренного электрона парамагнитного центра. Одна из этих линий соответствует синглетному каналу, другая - триплетному; расстояние между линиями отвечает энергии обменного взаимодействия (синглет-триплетное расщепление) в электронной паре "туннелирующий электон + неспаренный электрон парамагнитного центра". Отсюда можно определить размер нанорезонатора, скорость спиновой и колебательной релаксации и многое другое.

Ясно, что на основе этих открытий можно сделать следующий шаг - создать электронный парамагнитный резонанс единичного спина (атома, радикала, иона, любого другого спинового носителя). Уже разработана теория этого явления, на базе которой можно создавать экспериментальные устройства и спектрометры.

Лекция 3.Механика единичной молекулы

Атомно-силовая микроскопия измеряет силу притяжения между иглой микроскопа и поверхностью как функцию расстояния между ними (в отличие от туннельной сканирующей микроскопии, в которой измеряется ток между иглой и поверхностью). В классическом варианте атомно-силовая микроскопия является бесконтактной: игла скользит вдоль поверхности, не касаясь её. Силовая микроскопия также способна визуализировать одноатомные вакансии (реально - видеть от них пятна) на поверхности полупроводников и диэлектриков и адсорбированные молекулы (например, С60, аденин, перилен, ДНК), делать приближённые заключения о размерах и форме молекул, их густоте и расположении на поверхности. Надо признать, что из-за низкого пространственного разрешения это больше информация о поверхности, чем о молекулах, сидящих на ней.

Ситуация принципиально меняется, если атомно-силовую микроскопию сделать контактной: закрепить один конец молекулы на игле, а другой - на поверхности. Тогда, отодвигая иглу от поверхности и растягивая молекулу, можно измерять силу как функцию растяжения молекулы, т.е. исследовать механику единичной молекулы.

Эта идея была блестяще реализована экспериментально; главная интрига состояла в том, чтобы закрепить концы молекулы (обычно макромолекулы) ковалентными или координационными связями - в этом заключены и наука, и искусство.

Рис.4 показывает схему эксперимента и схематическую зависимость силы F от растяжения молекулы х.

pic4s.gif (1290 bytes)

Функция F(x), как правило, не является линейной, гуковской: на ней есть небольшие локальные пики - подъёмы и спады. Это свидетельство того, что при удлинении макромолекулы происходит её конформационное "раскручивание" - свёрнутые конформации под действием растяжения заменяются вытянутыми. Наконец, при некотором критическом удлинении полностью вытянутая молекула рвётся и сила разрыва есть прочность химической связи.

Эта восхитительная техника уже использована для измерения силы, которая удерживает антиген и антитело в едином комплексе; с её помощью измерялись силовые характеристики конформационных переходов в макромолекуле полисахарида. Наконец, измерена сила разрыва ковалентных связей: для Si- C она составила 2,0 наноньютона; прочность связи Au - S равна 1,4 наноньютона.

Особо следует отметить элегантные исследования наномеханики единичных макромолекул - и синтетических, и биологических. Например зависимость F(x) была детально исследована для водо-растворимых макромолекул полиакриламида и поли(N-изопропил)акриламида; преобразованная зависимость х(F) есть функция, характеризующая наномеханику макромолекулы, т.е. зависимость её длины от силы растяжения (упругость).

Image108a.gif (1061 bytes)

Для гибкоцепных макромолекул зависимость х(F) была выведена ещё в 1942 г. Куном из модели свободно сочленённой цепи; она описывается функцией Ланжевена

где I длина статистически независимого куновского сегмента, L контурная длина макромолекулы (расстояние между концами предельно вытянутой молекулы). Модель предполагает, что куновские сегменты неупруги, нерастяжимы. Прямые измерения x(F) для одиночных макромолекул показали, что x(F) описывается этой моделью только при очень малых силах F (десятки пиконьютонов, рN); при бoльших силах нужно допустить, что кулоновский сегмент является упругим элементом и тогда зависимость x(F) описывается обобщённым уравнением Ланжевена

где n число куновских сегментов (n = L/I), K модуль упругости куновского сегмента. Эксперимент хорошо описывается этой функцией вплоть до F appeq.gif (56 bytes) 1000 pN; найдено, что I = 0,68 нм, K = 26000 pN/нм, L = 460 нм.

Можно измерить также прочность нескольких сложенных вместе молекул; так была измерена прочность пучка из сотни углеродных нанотруб. Оказалось, что каждая нанотруба в 10 раз прочнее стальной проволоки того же диаметра. Результат впечатляющий, но он всё же ниже теоретической прочности и свидетельствует о механической дефектности либо самого пучка, либо мест его закрепления.

Атомно-силовая микроскопия единичных молекул - техника трудоёмкая и деликатная, но результаты её настолько привлекательны, что будущее её представляется блестящим.


Сервер создается при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
Не разрешается  копирование материалов и размещение на других Web-сайтах
Вебдизайн: Copyright (C) И. Миняйлова и В. Миняйлов
Copyright (C) Химический факультет МГУ
Написать письмо редактору