258-259
Молекулярная генетика. Генная инженерия
Полимеразная цепная реакция
Некоторые методы генной инженерии
приобретают все более важное значение в клинической практике.
А. Полимеразная цепная
реакция
Полимеразная цепная реакция [ПЦР (PCR)]
позволяет многократно воспроизводить (амплифицировать) выбранный фрагмент
ДНК без помощи рестриктаз, векторов или клетки-хозяина (см. с. 254). Для этого
нужно иметь в своем распоряжении два олигонуклеотида (праймера), каждый
из которых будет гибридизоваться с одной из цепей на противоположных концах
подлежащего амплификации фрагмента ДНК, достаточное количество
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и специальную термостабильную
ДНК-полимеразу. Праймер синтезируют, а полимеразу получают из
термостабильных бактерий.
На первой стадии двунитевую ДНК нагревают до 90оС
для разделения цепей и получения однонитевой ДНК (а).
Затем смесь охлаждают, чтобы произошла гибридизация с праймерами (б).
Комплементарные цепи ДНК синтезируются в обоих направлениях, начиная от праймеров
(в). Этот циклический процесс (цикл 1)
повторяют с той же самой реакционной смесью (цикл 2, 3
и т.д.) 20-30-кратно. Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию
между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. Их количество
удваивается после каждого цикла до тех пор, пока почти все синтезированные фрагменты
не будут соответствовать первоначальному фрагменту, ограниченному праймерами.
Циклы нагревания и охлаждения проводятся в термостате-амплификаторе с программируемым
температурным режимом.
Б. Анализ длины рестрикционных
фрагментов
Рестриктазы расщепляют ДНК в
специфических участках, обычно в палиндромных последовательностях (см. с. 254).
Когда одно из оснований в такой последовательности изменяется в результате
мутации, этот участок перестает расщепляться рестриктазами. В то же время
мутации могут приводить к образованию новых участков, чувствительных к
рестриктазе. В результате соответствующие фрагменты ДНК, полученной от двух
генетически не идентичных индивидов, часто образуют рестрикционные фрагменты
различной длины. Это явление носит название полиморфизма длин рестрикционных
фрагментов ДНК (ПДРФ, англ. restriction fragment length polimorphism,
RFLP).
На рис. 1 приведен метод выявления
ПДРФ. Прежде всего, ДНК-фрагмент, содержащий исследуемую последовательность,
амплифицируют с помощью ПЦР (А). Затем амплифицированный
фрагмент гидролизуют подходящей рестриктазой. Фрагменты разделяют гель-электрофорезом,
интересующий фрагмент выявляют с помощью специфичного генного зонда (см.
с. 256). На рис. 2 приведены
результаты применения метода в криминалистике. Рестрикционная карта образца
ДНК, выделенной из ткани, найденной на месте преступления, четко совпадает с
пробой, взятой у подозреваемого 2, а не у подозреваемого 1. Для получения такого
«генетического отпечатка" достаточно очень малого количества материала, содержащего
ДНК. Вторым важным практическим приложением ПДРФ-анализа является выявление
генетических мутаций, ведущих к наследственным заболеваниям.
В. Сверхэкспрессия
белков
Для лечения тех или иных заболеваний
необходимы белки, например белковые гормоны, которые у животных присутствуют в
малых количествах и поэтому труднодоступны. В настоящее время такие белки можно
получать в больших количествах при помощи сверхэкспрессии в бактериальных
или эукариотических клетках. Для этого необходимо выделить соответствующий
ген из ДНК человека и клонировать его в составе плазмиды. Кроме
этого гена плазмида должна содержать последовательность ДНК, которая делает
возможной репликацию и транскрипцию плазмидной ДНК в клетке-хозяине. Как только
подходящие клетки трансформированы плазмидой и произойдет репликация,
транскрипция гена инициируется путем индукции. Трансляция образовавшейся
мРНК в клетке-хозяине позволяет производить необходимый белок в достаточном
количестве.