Ознакомление с методами высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Определение параметров разделения смеси диастереомеров 2-арил-5-гидроксиадамантанов методом ВЭЖХ.

Задача спецпрактикума для студентов IV курса кафедры химии нефти и органического катализа.

Тема: Анализ смесей, разделение продуктов реакций, установление строения органических веществ

Цель работы.

Ознакомление студентов с методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Подбор оптимальных условий и определение параметров хроматографического разделения смеси диастереомерных 2-арил-5-гидроксиадамантанов. Изучение зависимости параметров разделения от состава элюента.

Основные понятия и классификация методов жидкостной хроматографии.

Жидкостную хроматографию подразделяют на несколько классов в зависимости от типа носителя неподвижной фазы. Простое аппаратурное оформление бумажной и тонкослойной хроматографий обусловили широкое использование этих методов в аналитической практике. Однако, большие возможности колоночной жидкостной хроматографии стимулировали совершенствование оборудования для этого классического метода и привели к быстрому внедрению ВЭЖХ. Пропускание элюента через колонку под высоким давлением позволило резко увеличить скорость анализа и существенно повысить эффективность разделения за счет использования мелкодисперсного сорбента. Метод ВЭЖХ в настоящее время позволяет выделять, количественно и качественно анализировать сложные смеси органических соединений.

По механизму взаимодействия разделяемого вещества (элюата) с неподвижной фазой различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, ион-парную, лигандообменную и аффинную хроматографии.

Адсорбционная хроматография. Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия разделяемого вещества с адсорбентом, таким как оксид алюминия или силикагель, имеющими на поверхности активные полярные центры. Растворитель (элюент) - неполярная жидкость. Механизм сорбции состоит в специфическом взаимодействии между полярной поверхностью сорбента и полярными (либо способными поляризоваться) участками молекул анализируемого компонента (рис. 1).

Рис. 1. Адсорбционная жидкостная хроматография.

Распределительная хроматография. При распределительном варианте жидкостной хроматографии разделение смеси веществ осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами - элюентом (подвижной фазой) и фазой, находящейся на сорбенте (неподвижная фаза).

При нормально-фазовом варианте распределительной жидкостной хроматографии используются неполярный элюент и полярные группы, привитые к поверхности сорбента (чаще всего силикагеля). В качестве модификаторов поверхности силикагеля (привитых фаз) используются замещенные алкилхлорсиланы, содержащие полярные группы, такие как нитрильная, аминогруппа и т. д. (рис. 2). Применение привитых фаз позволяет тонко управлять сорбционными свойствами поверхности неподвижной фазы и добиваться высокой эффективности разделения.

Рис. 2. Распределительная хроматография с привитой фазой (нормально-фазный вариант).

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография основана на распределении компонентов смеси между полярным элюентом и неполярными группами (длинными алкильными цепочками), привитыми к поверхности сорбента (рис. 3).

Рис. 3. Распределительная хроматография с привитой фазой (обращенно-фазный вариант).

Менее широко используется вариант жидкостной хроматографии с нанесенными фазами, когда жидкая неподвижная фаза наносится на неподвижный носитель.

Эксклюзивная (гель-проникающая) хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение веществ происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся в порах сорбента и растворителем, протекающим между его частицами.

Аффинная хроматография основана на специфических взаимодействиях разделяемых белков (антител) с привитыми на поверхности сорбента (синтетической смолы) веществами (антигенов), избирательно образующими с белками комплексы (коньюгаты).

Ионообменная, ион-парная, лигандообменная хроматографии применяются в основном в неорганическом анализе.

Основные параметры хроматографического разделения.

Основными параметрами хроматографического разделения являются удерживаемый объем и время удерживания компонента смеси (рис. 4).

Время удерживания tR - это время, прошедшее от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума соответствующего пика. Умножив время удерживания на объемную скорость элюента F , получим удерживаемый объем VR:

VR = tR .  F ;

Исправленое время удерживания - время, прошедшее с момента появления максимума пика несорбируемого компонента до пика соответствующего соединения:

tR' = tR - t0;

Приведенный или исправленный объем удерживания - это объем удерживания с поправкой на мертвый объем колонки V0, т. е. на объем удерживания несорбируемого компонента:

VR' = VR - V0;

Характеристикой удерживания является также коэффициент емкости k', определяемый как отношение массы вещества в неподвижной фазе к массе вещества в подвижной фазе: k' = mн / mп;

Величину k' легко определить по хроматограмме:

Важнейшими параметрами хроматографического разделения являются его эффективность и селективность.

Эффективность колонки, измеряемая высотой теоретических тарелок (ВЭТТ) и обратно пропорциональная их числу (N) тем выше, чем уже пик вещества, выходящего при том же времени удерживания. Значение эффективности может быть вычислено по хроматограмме по следующей формуле:

N = 5.54 . (tR /  1/2)2,

где tR - время удерживания,

w 1/2 - ширина пика на половине высоты

Зная число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, длину колонки L и средний диаметр зерна сорбента dc, легко получить значения высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ), и приведенной высоты (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L/N ПВЭТТ = ВЭТТ/dc

Эти характеристики позволяют сравнивать эффективности колонок различных типов, оценивать качество сорбента и качество заполнения колонок.

Селективность разделения двух веществ определяется по уравнению:

,

При рассмотрении разделения смеси двух компонентов важным параметром служит также степень разделения RS:

;

Пики считаются разрешенными, если величина RS больше или равна 1.5.

Основные хроматографические параметры связывает следующее уравнение для разрешения:

;

Факторами, определяющими селективность разделения, являются:
1) химическая природа сорбента;
2) состав растворителя и его модификаторов;
3) химическая структура и свойства компонентов разделяемой смеси;
4) температура колонки.

Аппаратура для жидкостной хроматографии.

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами.

На рис. 5. представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

Рис. 5. Блок-схема жидкостного хроматографа.

Насос (2) предназначен для создания постоянного потока растворителя. Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы плунжерного (шприцевого), либо пистонного типов. Недостатком первых является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом, а вторых - большая сложность конструкции и, как следствие, высокая цена. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа с успехом применяют недорогие перистальтические насосы, но так как при этом трудно добиться постоянства давления и скорости потока, их использование ограничено препаративными задачами.

Инжектор (3) обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы - "stop-flow" требуют остановки насоса и, поэтому, менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанные фирмой Reodyne.

Колонки (4) для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используют толстостенные стеклянные колонки. Постоянство температуры обеспечивается термостатом (5).

Детекторы (6) для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры, измеряющие показатель преломления, и спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения, которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно.

Регистрирующая (7) система в простейшем случае состоит из дифференциального усилителя и самописца. Желательно также наличие интегратора, позволяющего рассчитывать относительные площади получаемых пиков. В сложных хроматографических системах используется блок интерфейса, соединяющий хроматограф с персональным компьютером (8), который осуществляет не только сбор и обработку информации, но и управляет прибором.

Порядок выполнения работы.

В ходе выполнения данной работы анализируется смесь 2-арилгидроксиадамантанов, моделирующая состав продуктов изомеризации 2-арил-2-гидроксиадамантанов в среде трифторуксусной кислоты. Задача состоит в подборе оптимального состава элюента для эффективного разделения компонентов. Анализ проводят на жидкостном хроматографе "МИЛИХРОМ", используя нормально-фазный вариант ВЭЖХ.

Необходимое оборудование и материалы.

Реактивы:
1. (Z)- и (E)-2-арил-5-гидроксиадамантаны по 0.50 ммол,
2. Хлористый метилен - 20 мл,
3. н-Гептан ("для спектроскопии") - 50 мл,
4. 2-Пропанол (х.ч.) - 5 мл.

Оборудование:
1. Пробка стеклянная НШ 14 - 5 шт.,
2. Штатив для пробирок - 1 шт.,
3. Пробирки, 10 мл, НШ 14 - 5 шт.,
4. Пипетка градуированная, 2 мл - 2 шт.,
5. Шприц медицинский, 2-5 мл - 1 шт.,
6. Микропипетка автоматическая 100-250 мкл - 1 шт.,
7. Наконечники полиэтиленовые для пипетки - 10 шт.,
8. Колба Бюхнера с мелким фильтром Шотта - 1 шт.,
9. Колба коническая со стеклянной пробкой, 100 мл - 1 шт.,
10. Хроматограф жидкостной "МИЛИХРОМ" - 1 шт.,
11. Самописец, входное напряжение 100 мВ - 1 шт.,
12. Интегратор - 1 шт.,
13. Колонка хроматографическая типа КАХ-1 (Silasorb-600) - 1 шт.

Приготовление элюента для ВЭЖХ и проведение анализа проб.

Готовят в мерных пробирках по 10 мл следующих элюентов, в соответствии с табл.1.

Таблица 1.

Состав элюентов для ВЭЖХ.

N

н-гептан (об.%)

CH2Cl2 (об.%)

изо-пропанол (об.%)

1

69.9

30.0

0.1

2

69.5

30.0

0.5

3

69.0

30.0

1.0

4

68.0

30.0

2.0

5

65.0

30.0

5.0

Фильтруют элюенты в вакууме водоструйного насоса через мелкий фильтр Шотта для удаления микропримесей и дегазирования.
ВНИМАНИЕ! ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕПРОФИЛЬТРОВАННОГО ЭЛЮЕНТА МОЖЕТ ПРИВЕСТИ К ПОРЧЕ ХРОМАТОГРАФА!!!
Готовят анализируемую пробу - раствор равных количеств (Z)- и (E)-изомеров 2-арил-5-гидроксиадамантана в хлористом метилене. Включают хроматограф и заполняют шприц элюентом. Устанавливают следующие режимы работы прибора: чувствительность A - 0.80, частота S - 1.2, длина волны - 254 nm, скорость потока элюента - 50-100 мкл/min, скорость бумаги - 0.06 - 0.15 см/мин, объем пробы - 4-6 мл.

Анализируют пробу, используя различные элюенты по 3-5 раз. Первым выходит пик примесей и воздух ("нулевой объем"), затем - (Z)- и (E)-изомеры 2-арил-5-гидроксиадамантана.

Обработка результатов.

Заполняют следующую таблицу, рассчитывая величины эффективности (N) для каждого из изомеров 2-арил-5-гидроксиадамантанов, усредняя их для каждого из элюентов и рассчитывая значения селективности ( ) и разрешения (RS).

Строят зависимости эффективности, селективности и разрешения хроматографического разделения от состава подвижной фазы. На основе анализа полученных закономерностей делают вывод об оптимальном составе элюента.

Таблица 2.

Влияние состава элюента на параметры хроматографического разделения

N

изо-PrOH,
(об.%)

t0

tR-Z

w 1/2-Z

NZ

tR-E

w 1/2-E

NE

a

RS

1

 0.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ...
    ... ... ... ... ... ... ... ... ...
    ... ... ... ... ... ... ... ... ...
  Среднее ... ... ... ... ... ... ... ... ...

2

 0.5 ... ... ... ... ... ... ... ... ...
    ... ... ... ... ... ... ... ... ...

Литература

  1. Препаративная жидкостная хроматография / под. ред. Б. Бидлингмейера - М.:Мир, 1990.
  2. Стыскин Е.Л., Илинсон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М. : Химия 1986.
  3. Engelhard H. Practice of High Performance liquid chromatography. Application Equipment and Quantitative Analysis / NY., Springier-Verlag, 1983.