Избранные главы химии
(курсы по выбору на русском языке)

Хроматография и масс-спектрометрия в биоаналитических задачах

Лектор(ы): В.н.с. д.х.н.  И.А. Родин, доц. к.х.н. А.Н. Ставрианиди

В данном курсе рассматриваются методология применения хроматографических и масс-спектрометрических методов в анализе объектов биологического происхождения.

Обсуждаются физико-химические основы методов хроматографии и масс-спектрометрии, и вытекающие их этих основ особенности, возможности и ограничения данных методов как инструментов в биохимических исследованиях.

Рассматривается основные типы биоаналитических задач, с учетом их специфики и типовой проблематики, решаемые с использованием хроматографии и масс-спектрометрии.

Обсуждаются вопросы использования различных вариантов хроматографии и масс-спектрометрии с учетом специфики конкретных задач.

Программа лекций

Часть 1. Методы разделения в биоаналитических задачах (лектор доц. к.х.н. А.Н. Ставрианиди)

Лекция 1. Хроматографические методы анализа. Основные понятия.

В лекции будут рассмотрены основные принципы хроматографического анализа, даны определения сорбата, сорбента, элюента и элюата, а также будет дана краткая информация об истории открытия этого метода. Будут рассмотрены основные параметры, расчет которых позволяет охарактеризовать хроматографическое разделение, включая время удерживания, исправленное время удерживания, удерживаемый объем, индексы удерживания, фактор удерживания (коэффициент емкости), мертвое время, селективность, разрешение, коэффициент асимметрии пика, а также рассмотрены основные положения кинетической теории хроматографии, уравнение Ван-Деемтера и расчет параметров эффективности (числа теоретических тарелок и высоты теоретической тарелки). В данной лекции будет рассмотрена классификация хроматографических методов, в т.ч. по технике и цели применения. Заключительная часть лекции будет посвящена основным принципам детектирования и способам проведения количественного хроматографического анализа.

Лекция 2. Газовая хроматография и ее применение в анализе объектов биологического происхождения.

В лекции будут рассмотрены основные принципы разделения в газовой хроматографии; перечислены основные типы неподвижных фаз и колонок; кратко рассмотрена схема устройства газового хроматографа; приведены схемы устройства и основные принципы работы наиболее распространенных детекторов (кроме масс-спектрометрического): катарометр, пламенно-ионизационный детектор, электронозахватный детектор, азотно-фосфорный детектор. Отдельно будут описаны принципы реакционной газовой хроматографии и затронуты вопросы пробоподготовки и ввода пробы, включая ввод нагретого пара (Headspace), термодесорбцию, твердофазную микроэкстракцию. Заключительная часть лекции будет посвящена применению газовой хроматографии в анализе различных объектов биологического происхождения.

Лекция 3. Жидкостная хроматография и ее применение в анализе объектов биологического происхождения.

В лекции будет дана подробная классификация существующих видов жидкостной хроматографии; будут рассмотрены основные принципы разделения в нормально-фазовой, обращенно-фазовой и гидрофильной жидкостной хроматографии; перечислены основные типы неподвижных фаз и колонок; кратко рассмотрена схема устройства жидкостного хроматографа; приведены схемы устройства и основные принципы работы наиболее распространенных детекторов (кроме масс-спектрометрического): спектрофотометрического, флуориметрического, амперометрического; описан метод градинетного элюирования в жидкостной хроматографии; показаны отличия и преимущества современных вариантов жидкостной хроматографии: высокоэффективной жидкостной и ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии. Заключительная часть лекции будет посвящена применению рассмотренных вариантов жидкостной хроматографии в анализе различных объектов биологического происхождения.

Лекция 4. Ионная хроматография. Основы метода и применение в анализе водорастворимых органических соединений, катионов и анионов.

В лекции будут рассмотрены основные принципы ионообменной хроматографии; перечислены основные типы неподвижных фаз и колонок; рассмотрена схема устройства ионного хроматографа с кондуктометрическим детектором; представлены традиционные и современные системы подавления фонового сигнала. Будут приведены хроматограммы сильно и слабо удерживаемых катионов и анионов, а также полярных органических соединений, кислот, сахаров, аминов. Отдельно будет рассмотрена ион-парная хроматография. Заключительная часть лекции будет посвящена применению ионной хроматографии в анализе различных объектов биологического происхождения.

Лекция 5. Эксклюзионная и ион-эксклюзионная хроматография. Препаративная жидкостная хроматография. Разделение и выделение биоорганических соединений.

В первой части лекции будут рассмотрены основные принципы эксклюзионной хроматографии; перечислены основные типы неподвижных фаз и колонок; показан принцип работы и применение рефрактометрического детектора. Отдельно будет рассмотрена ион-эксклюзионная хроматография. Во второй части лекции будут описаны основные принципы препаративной хроматографии с использованием стеклянных и металлических колонок; перечислены основные типы неподвижных фаз. Будут затронуты вопросы, касающиеся пробоподготовки перед хроматографическим разделением, сбора и очистки выделяемых фракций. Заключительная часть лекции будет посвящена применению препаративной хроматографии для выделения биоактивных соединений из различных объектов биологического происхождения.

Лекция 6. Применение электрофореза в биохимическом анализе. Мицеллярная электрокинетическая хроматография и капиллярный гель-электрофорез.

В лекции будут рассмотрены основные принципы капиллярного электрофореза и родственных методов анализа, таких как капиллярный гель-электрофорез, электрохроматография, мицеллярная электрокинетическая хроматография; представлены схемы удерживания и разделения катионов, анионов и нейтральных молекул; перечислены факторы, влияющие на разделение и основные типы используемых детекторов. Отдельно будут рассмотрены способы ввода пробы и он-лайн концентрирования определяемых компонентов. Заключительная часть лекции будет посвящена применению электрофореза в анализе различных объектов биологического происхождения.

Лекция 7. Тонкослойная хроматография и иммунохроматографический анализ. Лигандообменная хроматография. Разделение оптических изомеров.

В первой части лекции будут рассмотрены основные принципы разделения в тонкослойной хроматографии; перечислены основные типы неподвижных фаз и пластин-подложек; кратко рассмотрена схема современных систем для проведения анализа методом тонкослойной хроматографии и используемые способы детектирования. Отдельно будут описаны принципы иммунохроматографического анализа и затронуты вопросы подготовки и нанесения неподвижной фазы на подложки. Во второй части лекции будут рассмотрены основные принципы разделения в лигандообменной хроматографии. Заключительная часть лекции будет посвящена применению афинной и хиральной хроматографии в анализе различных объектов биологического происхождения.

Часть 2. Масс-спектрометрические методы в биоаналитических задачах (лектор в.н.с. д.х.н. И.А. Родин)

Лекция 1. Масс-спектрометрия. Основные понятия, история, классификация масс-спектрометрических методов.

В лекции будут рассмотрены основные понятия масс-спектрометрического анализа, дана краткая историческая сводка развития данной группы методов, а также будет рассмотрены принципы классифицирования важнейших масс-спектрометрических методов

Лекция 2. Физические основы масс-спектрометрии. Вакуумные системы масс-спектрометров, детектирование ионов.

В лекции будут рассмотрены основные физико-химические принципы масс-спектрометрического анализа, выделены принципиальное важные этапы масс-спектрометрического эксперимента, описаны способы создания, поддержания и контроля вакуума, используемые в современных приборах, а также будет рассмотрены принципы детектирования ионов в масс-спектрометрии.

Лекция 3. Первичная обработка и интерпретация масс-спектральных данных. Масс-спектрометрия прямого ввода и хромато-масс-спектрометрия.

В лекции будут рассмотрены основные способы формирования масс-спектров по результатам измерений, получаемых в эксперименте. Описаны способы обработки данных (вычитание фона, усреднение, деконволюция). Будет проведено критическое сравнение различных техник ввода пробы (прямой ввод, хромато-масс-спектрометрия).

Лекция 4. Методы ионизации в масс-спектрометрии при решении задач биоаналитики.

В лекции будут рассмотрены основные физико-химические принципы процессов ионизации (ионизация электронами, химическая ионизация, ионизация электрораспылением, химическая и фотохимическая ионизация при атмосферном давлении, МАЛДИ и др). Будет проведено критическое сравнение указанных методов с учетом возможностей и ограничений, а также областей применения.

Лекция 5. Масс-анализаторы.

В лекции будут рассмотрены основные типы масс-анализаторов, используемых в современных биоаналитических исследованиях (квадруполи, квадрупольные ионные ловушки, орбитальная ловушка, масс-спектрометр ИЦР, времяпролетный масс-спектрометр) Будет проведено критическое сравнение указанных методов с учетом возможностей и ограничений, а также областей применения.

Лекция 6. Тандемная масс-спектрометрия.

В лекции будут рассмотрены основные принципы тандемной масс-спектрометрии, а также приборы гибридной геометрии (квадруполь-времяпролетный, ионные ловушки, тройной квадруполь и др.) Будет проведено критическое сравнение указанных методов с учетом возможностей и ограничений, а также областей применения.

Лекция 7. Применение масс-спектрометрии в метаболомном анализе.

В лекции будут рассмотрены основные задачи, решаемые в области метаболомного анализа: целевой и нецелевой метаболомный анализ, метаболомное профилирование, терапевтический лекарственный мониторинг, идентификация метаболитов, фармакокинетические исследования.

Лекция 8. Применение масс-спектрометрии в пептидом, протеомном и биополимерном анализе.

В лекции будут рассмотрены основные задачи, решаемые в области протеомного и пептидного анализа: установление аминокислотной последовательности, целевой и нецелевой пептидный анализ, протеомика, идентификация микроорганизмов.