Современные проблемы химии
(курсы по выбору на русском языке)

Методы молекулярной биологии

Лектор(ы): С.П. Королев, к.х.н.

Курс посвящен обзору современных подходов и методов, используемых в экспериментальной биоорганической химии и молекулярной биологии. В курсе рассмотрены особенности модельных организмов, используемых в качестве объектов культивирования и изучения. Студенты будут ознакомлены с методами исследования клеток, их компонентов и отдельных биополимеров. Подробно рассмотрены методы разделения компонентов клетки, включая различные варианты хроматографии, выделения, очистки и детекции биополимеров, основные методы определения их структуры (ядерный магнитный резонанс, рентгеноструктурный анализ, крио-электронная микроскопия и другие). В ходе обучения студенты знакомятся с подходами методами генетической инженерии и геномного редактирования, секвенирования ДНК, микроскопией (световая, флуоресцентная, сверхразрешения и электронная), MALDI масс-спектрометрией. Отдельный раздел посвящен полногеномным и высокопроизводительным методам исследования, созданию и использованию комбинаторных библиотек.

Программа курса включает освоение пяти тем:

Тема 1. Клетки и модельные организмы. Три домена, на которые разделяются все живые организмы. Строение прокариотических клеток бактерий (грам-положительные и грам-отрицательные) и архей. Строение клеток эукариот: органеллы, цитоскелет, организация генома. Различия про- и эукариот. Модельные организмы (Bacillus subtilis, Streptomyces coelicolor, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana, Danio Rerio, Mus musculus, лабораторные клеточные линии человека, органоиды, сфероиды, микрофлюидные системы "Organ-on-a-chip" и "Man-on-a-chip"): их характеристика, особенности, преимущества и недостатки, способы культавации в лаборатории. Коллекции штаммов бактерий и дрожжей.

Тема 2. Микроскопия. Микроскопия видимого света. Разрешение. Микроскопия: светлого поля, темного поля, фазового контраста, дифференциально-интерференционная контрастна. Флуоресцентная микроскопия. Конфокальный микроскоп. Методы окрашивания в микроскопии видимого света и флуоресцентной микроскопии. Как ввести флуоресцентную метку в белки, РНК и ДНК. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Резонансный перенос энергии (FRET). Принцип работы клеточного сортера (FACS). Подходы к преодолению дифракционного предела в микроскопии. Микроскопия сверхразрешения: структурированного освещения (SIM), подавления спонтанного испускания (STED), стохастической оптической реконструкции (STORM), фотоактивируемая локализационная (PALM), полного внутреннего отражения (TIRF). Атомно-силовая микроскопия. Электронная микроскопия: просвечивающая и сканирующая. Крио-электронная томография. Крио-электронная микроскопия.

Тема 3. Методы выделения и детекции компонентов клетки. Способы разрушения клеток бактерий, дрожжей и млекопитающих. Виды центрифугирования. Типы хроматографии: гель-фильтрация, гидрофобная, катионо- и анионообменная, аффинная. Варианты аффинных довесков (тагов): 6хHis, GST, protein A, биотин. Методы присоединения к смоле: N-гидроксисункцинимид (NHS), BrCN, эпоксин, гидразид. Методы выделения и очистки белков, ДНК и РНК из клеток. Диализ. Гель-электрофорез ДНК и РНК: агарозный и полиакриламидный. Детекция ДНК и РНК в геле: красители, радиоизотопы, флюоресцентные метки. Блоттинг по Саузерну и Нозерн-блоттинг. Принципы разделения белков электрофорезом в ПААГ. Детекция белков окрашиванием кумасси, серебром. Иммуноблоттинг. Изоэлектрофокусирование. Двумерный гель-электрофорез. Идентификация белков при помощи масс-спектрометрии MALDI и ESI. Top-down и Bottom-up подходы в протеомике.

Тема 4. Генетическая инженерия. Ферменты и реакции, применяемые в генной инженерии. Эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигаза, полинуклеотид-киназа, щелочная фосфатаза. ДНК-полимеразы. Бесшовное клонирование (Gibson assembly, golden gate cloning). Сайт-направленный мутагенез (Quikchange). ДНК дактилоскопия (DNA profiling). Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Полимеразы, используемые для ПЦР. Количественная и цифровая ПЦР. Секвенирование ДНК: химическое, энзиматическое, по Сэнгеру, NGS (Illumina, нанопоровое). Анализ транскриптома (RNAseq). Рибосомный профайлинг (Ribo-seq). Бисульфитное секвенирование. Исследование пространственной структуры РНК. Chromosome conformation capture (3C и Hi-C). Бактериальные и дрожжевые вектора и их свойства: ориджины репликации, маркеры (селективные, репортерные, ауксотрофные), промоторы, полилинкер. Бакуловирусные вектора. Способы введения рекомбинантной ДНК в клетки прокариот и эукариот. Репликация плазмидной ДНК в клетках бактерий и эукариот. Системы трансдукции эукариотических клеток: лентивирусы, аденоассоциированные вирусы. Транспозоны. РНК-интерференция. Временный и стабильный нокдаун: siRNA, shRNA. Способы доставки в клетки. Использование гомологической рекомбинации для редактирования геномов бактерий, дрожжей, высших эукариот. Цинк-пальцевые нуклеазы. TALE нуклеазы. Иммунная система бактерий CRISPR-Cas. Её модификации для применения в генном редактировании с использованием NHEJ или гомологичной рекомбинации, для регуляции экспрессии генов и картирования участков генома. Система Cre/Lox: инверсия, делеция, транслокация, вставка. Варианты ее применения: тканеспецифичное или индуцибельное применение рекомбиназы Cre. Brainbow. Получение трансгенных животных. Инъекции в бластоцисту. Мозаичные животные. Инъекция в зиготу. Варианты доставки генетического материала в зиготу.

Тема 5. Методы определения структуры макромолекул и их взаимодействия. Соосаждение макромолекулярных комплексов. Варианты аффинных довесков (тагов): Strep, TAP, MBP, иммуногенные пептиды (FLAG, myc, HA). Ко-иммунопреципитация. Другие способы иммобилизации белков: HaloTag, SNAP-tag, CLIP-tag. Биоконъюгация белков: SpyTag/SpyCatcher, DogTag/DogCatcher. Иммунопреципитация хроматина (ChIP и ChIPseq). Определение сближенных участков хромосом (DamID). Выделение комплексов с РНК. Дрожжевая двугибридная система (Y2H). Bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Мечениесближенныхбелков (BioID и APEX). Делеционный анализ. Мутации мест связывания (сканирующий мутагенез). Кросс-линкинг (сшивки). Ограниченный протеолиз. Метод "торможения в геле". Химический и ферментативный футпринтинг РНК и ДНК. Тоупринтинг. Поверхностный плазмонный резонанс (SPR). Изотермическая титрационная калориметрия (ITC). Ядерный магнитный резонанс. Одномерный, двумерный (COSY, NOESY, HSQC). Получение белков со стабильными изотопами. ЯМР скрининг и оптимизация структуры лиганда. Рентгеноструктурный анализ. Методы решения "проблемы фаз". Выращивание кристаллов. AlphaFold – компьютерное предсказание структуры белка.

Зачет по курсу будет проходить в формате устного собеседования. В билеты включены вопрос по методам молекулярной биологии, а также теоретическая задача по применению молекулярно-биологических методов.