[На предыдущую часть]

В следующей серии экспериментов были использована лейкомасса и плазма крови больных с бронхолегочными заболеваниями. В этих образцах плазмы спектрофлуориметрически определяли содержание эндогенных порфиринов. Было обнаружено, что (рис. 5А) ЛО клеток лейкомассы с плазмой крови, содержащей порфирин, в интервале доз ЛО от 0 до 5 Дж/см² сопровождается двухфазным изменением интенсивности ЛХЛ ПМЛ на последующую стимуляцию ОЗ. Доза ЛО, приводящая к максимальному увеличению функционального потенциала ПМЛ, зависела от содержания порфирина в добавляемой плазме. Так, в случае использования плазмы крови больного с бронхиальной астмой, содержащей в 20 мкл 8,5·10^–12 молей порфирина, максимальный Хл-ответ ПМЛ на последующую после ЛО стимуляцию ОЗ (около 70% над контролем) наблюдали при дозе 0,26 Дж/см² (рис. 5А, кривая 1). Дальнейшее увеличение дозы ЛО приводило к угнетению ЛХЛ ПМЛ и, например, при дозе 5,2 Дж/см² величина Хл-ответа лейкоцитов крови больного бронхиальной астмой уменьшилась на 40% по отношению к контролю. При ЛО лейкомассы крови другого больного с пневмонией легких, в плазме которого содержалось в 2 раза меньше Ф/С, 4,1·10^–12 моля порфирина, максимальный Хл-ответ ПМЛ наблюдали при дозе ЛО 1,05 Дж/см² (рис. 5А, кривая 2). Аналогичные по характеру результаты были получены Мештером и сотр. [33], которые изучали влияние на фагоцитарную активность лейкоцитов светового воздействия в присутствии в качестве Ф/С метиленового синего. Иными словами, чем больше фотосенсибилизатора содержится в суспензии клеток лейкомассы, тем меньшая доза ЛО требуется для достижения максимального увеличения функционального потенциала фагоцитов. ЛО клеток лейкомассы без добавленной плазмы (рис. 5А, кривая 3) не вызывало сколько-нибудь значительного изменения функциональной активности лейкоцитов. Эти результаты свидетельствуют о том, что эффекты ЛО в присутствии плазмы крови определяются в основном наличием в ней Ф/С.

На рис. 5Б представлены результаты влияния ЛО суспензии фагоцитов в дозе 0,32 Дж/см² в зависимости от количества порфиринов, содержащихся в 20 мкл добавленной плазмы крови. Видно, что по мере увеличения количества молей эндогенных порфиринов величина Хл-ответа лейкоцитов возрастала, достигая максимума при содержании 16,4{U 8729}10^–12 молей порфиринов. Дальнейшее увеличение содержания эндогенных фотосенсибилизаторов приводило к ингибированию функциональной активности фагоцитов.

Полученные результаты позволяют заключить, что ЛО может изменять функциональный потенциал лейкоцитов крови благодаря участию как фотосенсибилизаторов, локализованных в мембранах лейкоцитов, так и хромофоров, локализованных в непосредственной близости от клеток: в составе липопротеидов и белков плазмы или растворённых в воде. В первом случае эффект действия фотосенсибилизатора может быть обусловлен инициацией фотосенсибилизированных СРР непосредственно в мембране клетки и её последующей перекисной модификацией. Во втором случае, образование радикалов-инициаторов, например ¹О₂ , может происходить на определённом расстоянии от поверхности лейкоцитов. Это расстояние определяется длиной пути диффузии образовавшихся ¹О₂ – около 50 А [34]. Однако возможен и другой путь перекисной модификации клеточных мембран лейкоцитов при ЛО в присутствии плазмы крови. Он состоит в инициации фотоперекисного окисления липидов липопротеидов с образованием в них определённого количества гидроперекисей, которые при контакте с клетками могут вызывать увеличение функционального потенциала лейкоцитов. Такая возможность была показана нами экспериментально в процессе инкубации лейкоцитов с окисленными фосфолипидами [35].

Суть этого явления состоит в том, что взаимодействие лейкоцитов с каким-либо стимулом в очень малой концентрации, не приводящее к прямой активации клеток, тем не менее завершается увеличением функционального потенциала лейкоцитов, которое проявляется в том, что ответ клеток после этого взаимодействия на повторную стимуляцию с нормальной концентрацией второго стимула увеличивается в несколько раз (рис. 2). Прайминг лейкоцитов может вызываться широким набором самых разнообразных воздействий и факторов [29]. По времени предъинкубации и выраженности ответа на второй стимул, чувствительности к ингибиторам синтеза белка и другим параметрам прайминг лейкоцитов можно подразделить на два типа, различающихся по времени взаимодействия клеток с первым стимулом: кратковременный и пролонгированный. В случае пролонгированного прайминга фагоцитов время инкубации клеток с первым стимулом должно быть 20–40 ч. Кратковременный прайминг лейкоцитов характеризуется следующими особенностями: период инкубации клеток с первым стимулом, за время которого повышается функциональный потенциал лейкоцитов, лежит в пределах от 2–5 мин до 1 ч, а ключевой стадией кратковременного прайминга является увеличение концентрации цитозольного кальция [29].

Прайминг лейкоцитов изучается уже более 10 лет. Однако молекулярный механизм его до конца не ясен. Высказано предположение, что увеличение функционального потенциала фагоцитов в процессе ПР может быть следствием модификации механизма трансдукции сигнала взаимодействия стимулятор-рецептор на внутриклеточные ферментативные системы с последующей их активацией, а также увеличения количества и аффинности поверхностных рецепторов [29].

Большую роль в обеспечении трансдукции сигнала играет изменение содержания цитозольного кальция фагоцитов. В связи с этим возникают два вопроса:

1) происходит ли в процессе ПР увеличение концентрации ионов Са²⁺ в цитозоле фагоцитов? и

В качестве доказательства участия ионов цитозольного кальция [Ca²⁺]_цит в ПР лейкоцитов можно использовать две группы экспериментальных данных: влияние ионофоров Са²⁺ на ПР фагоцитов и влияние агентов-праймеров на содержание цитозольного кальция в клетках. Действительно, при использовании ионофоров Са²⁺: иономицина и А23187, – было показано, что в концентрациях 1–10 нМ они формируют ПР гранулоцитов, выражающийся в трех-четырехкратном увеличении продукции АФК на последующую стимуляцию формил-метионил-лейцил-фенилаланином (ФМЛФ), форболовым эфиром миристиновой и уксусной кислот (ФМА) и ОЗ [29]. При этом минимальное время предъинкубации, необходимое для ПР, составляло 1–2 мин., и существенно сокращался лаг-период развития Хл-ответа гранулоцитов. Наблюдалась хорошая корреляция между эффективностью прайминга (величина ИП) и увеличением [Ca²⁺]_цит. Возрастание внутриклеточной концентрации ионов Са²⁺ на 0,8 мкМ приводила к увеличению ИП в 1,5 раза [29].

Кроме этого, было обнаружено, что некоторые стимуляторы, применяемые в качестве праймеров, способны увеличивать содержание ионов кальция в цитозоле фагоцитов. К их числу следует отнести липополисахариды (ЛПС), (ФМЛФ), лейкотриен В₄ (ЛТВ₄), фактор агрегации тромбоцитов (ФАТ), продукты перекисного окисления липидов, электрический пробой плазматических мембран фагоцитов [35–39]. Увеличение содержания ионов кальция в цитозоле лейкоцитов в процессе праймирования и стимуляции может быть следствием входа ионов Са²⁺ в цитозоль клетки из внешней среды, выхода из внутриклеточных депо (рис. 6) и ингибирования внутриклеточной Са²⁺-АТФ-азы, обеспечивающей реаккумуляцию цитозольного Са²⁺ обратно в депо [29].

Увеличение содержания ионов Са²⁺ в цитозоле фагоцитов может вызывать активацию нескольких ключевых систем для запуска ПР (рис. 6). Прежде всего, это Са²⁺-зависимые фосфолипазы, осуществляющие гидролиз фосфолипидов с образованием диацилглицерина (ДАГ), полиненасыщенных жирных кислот и др., которые вместе с цитозольным Са²⁺ активируют протеин-киназу С (ПКС) и последующее фосфорилирование цитозольных и мембраносвязанных белков. Так, в опытах с ДАГ в качестве праймера было обнаружено, что ДАГ-зависимый ПР ПМЛ сопровождается транслокацией фосфорилированных цитозольных белков p47phox (phagocyte oxidase) и p67phox на плазматическую мембрану, где они встраиваются в NADPH-оксидазу. В исходных, неактивированых фагоцитах компоненты мембраносвязанной NADPH-оксидазы образуют лабильный комплекс, который в SDS-электрофорезе формирует две полосы [29]. Ассоциация этих фосфорилированных цитозольных белковых факторов с мембраносвязанными компонентами НАДФH-оксидазы переводит фермент в активированное состояние, при котором он способен окислять NADPH и восстанвливать кислород до супероксид-анион-радикала (рис. 6). Менее ясен механизм прайминга фагоцитов для случаев, когда использовались праймеры, действие которых разворачивалось на фоне неизменной концентрации цитозольного кальция. К ним в первую очередь следует отнести фактор некроза опухоли (ФНОa ), гранулоцит-колоний стимулирующий фактор (Г-КСФ). При этом отмечается фосфорилирование ряда цитозольных белков по тирозиновым остаткам с участием тирозин-киназы, которая найдена как в цитозоле, так и в мембранной фракции ПМЛ [29].

[На следующую часть] [На Список литературы]

Copyright ©