[На предыдущую часть]

Суммируя полученные результаты, можно предположить, что Са²⁺-зависимый и Са²⁺-независимый прайминг фагоцитов проходит через несколько стадий: активация ПКС и/или ТК, фосфорилирование ряда цитозольных белков, транслокация некоторых из них из цитозоля на плазматическую мембрану и встраивание в мембраносвязанные компоненты НАДФH-оксидазы, формирование и наработка активного комплекса оксидазы, функционирование которого запускается при последующей стимуляции.

Второе проявление прайминга фагоцитов – экспрессия рецепторного аппарата. В большом количестве работ показано, что в процессе кратковременного и пролонгированного прайминга наблюдается увеличение количества и аффинности различных поверхностных рецепторов: Fc-R, ФАТ, ЛТB₄, C_3b, ламинина, ФМЛФ, трансферина и др. [29].

Экспрессия поверхностных рецепторов в процессе обработки ПМЛ различными праймерами протекает довольно быстро и независимо от присутствия ингибиторов синтеза белка [35]. Это позволило сделать следующие предположения:

1. Появление на поверхности ПМЛ новых рецепторов – это не результат активации синтеза de novo, тем более, что ПМЛ, будучи терминально-дифференцированными клетками, не обладают развитым синтетическим аппаратом.
2. Экспрессия рецепторного аппарата ПМЛ в результате прайминга есть следствие появления на поверхности клеток так называемых предсуществующих “загадочных” рецепторов в процессе дегрануляции, т.е. источником таких рецепторов могут быть гранулы ПМЛ [29].

Таким образом, прайминг фагоцитов, приводящий к увеличению функционального потенциала клеток, определяется по крайней мере двумя основными механизмами: наработкой комплексов НАДФH-оксидазы, которые находятся в потенциально активном состоянии, и экспрессией рецепторного аппарата. Все это вместе взятое при последующей за праймингом стандартной стимуляции реализуется в более мощном ответе фагоцитов на стимуляцию, в увеличении продукции АФК и других прооксидантов, в увеличении цитотоксичности и бактерицидности и других функциональных проявлениях.

Содержание порфиринов в плазме крови определяли спектрофлуориметрическим методом [32], а концентрацию ионов кальция в цитоплазме лейкоцитов – с помощью флуоресцентного зонда, Fura-2 [40, 41].

Лазерное облучение суспензии ПМЛ в присутствии небольшого количества плазмы крови (10 мкл) приводило к увеличению интенсивности флуоресценции Fura-2, что свидетельствует о возрастании концентрации ионов кальция в цитозоле лейкоцитов (рис. 7А).

Оказалось, что изменение содержания внутриклеточного кальция в лейкоцитах в присутствии плазмы крови, зависело от дозы лазерного излучения (рис. 8). Так, в первом случае (рис. 8, кривая 1), когда в 10 мкл введённой плазмы количество эндогенных порфиринов состовляло 0,32{U 8729}10^–12 молей, прирост концентрации ионов кальция в цитозоле ПМЛ увеличился пропорционально дозе ЛО, достигая максимума при дозе 0,45 Дж/см², и составил 73± 3,5 нМ. Дальнейшее увеличение дозы ЛО приводило к уменьшению ёмкости клеток для ионов кальция. Во втором случае (рис. 8, кривая 2), при использовании другого препарата плазмы, в 10 мкл которой содержалось 0,20{U 8729}10^–12 молей эндогенных порфиринов, максимальное увеличение концентрации цитозольного кальция наблюдалось при большей дозе ЛО по сравнению с предыдущим случаем и составляло 94,3± 4,8 нМ. Дальнейшее увеличение дозы ЛО, как и в предыдущем случае, приводило к уменьшению содержания ионов кальция в цитозоле ПМЛ. Иными словами, большему содержанию эндогенных порфиринов в суспензии ПМЛ соответствует меньшая доза ЛО, приводящая к достижению максимального содержания внутриклеточного кальция.

Во второй серии опытов лазерному облучению подвергались лейкоциты в растворе Хенкса в присутствии экзогенного фотосенсибилизатора, применяемого при фотодинамической терапии опухолей, фталоцианина (фотосенс) [3]. Было обнаружено, что после лазерного облучения суспензии лейкоцитов в присутствии фотосенсибилизатора увеличивается интенсивность флуоресценции Fura-2. На рис. 9, кривая 1, представлена дозовая зависимость изменения концентрации ионов кальция в цитоплазме ПМЛ в присутствии 10 нМ фотосенса. Видно, что увеличение дозы ЛО от 0,05 до 0,3 Дж/см² приводило к возрастанию содержания цитозольного Са²⁺ , при этом максимальный прирост составил 85± 7,6 нМ. Дальнейшее увеличение дозы ЛО – до 0,8 Дж/см² сопровождалось уменьшением концентрации ионов кальция до 34± 4,8 нМ.

Лазер-индуцированное изменение содержания цитозольного кальция зависело и от концентрации фотосенсибилизатора, добавляемого к лейкоцитам. Доза ЛО в этом случае была выбрана равной 0,25 Дж/см². Было обнаружено (рис. 9, кривая 2), что при концентрации фотосенса равной 0,1 и 10 нМ содержание кальция в цитоплазме ПМЛ увеличилось с 6,9± 0,7 нМ и 29,6± 4,5 нМ соответственно. Дальнейшее возрастание концентрации экзогенного фотосенсибилизатора приводило к постепенному падению прироста кальция и при концентрации фотосенса в 100 нМ он составил 7,44± 4,3 нМ.

Представляло интерес выяснить, откуда поступает кальций в цитоплазму ПМЛ при лазерном облучении: из внутриклеточных депо или из внешней среды? Для ответа на этот вопрос ЛО суспензии ПМЛ проводили в присутствии комплексона ионов Са²⁺ – EGTA и блокатора кальциевых каналов в плазматической мембране – верапамила. Было обнаружено (рис. 7Б), что после облучения суспензии ПМЛ без EGTA наблюдалось увеличение концентрации кальция на 60 нМ. Добавление в суспензию клеток, нагруженных ФЗ, EGTA до конечной концентрации 2 мМ, приводило к уменьшению концентрации Са²⁺. Оказалось, что лазерное облучение суспензии ПМЛ в присутствии EGTA не приводило к увеличению концентрации кальция в цитоплазме ПМЛ (рис. 7Б). Введение в суспензию ПМЛ специфического блокатора кальциевых каналов – верапамила [40] также предотвращало лазер-индуцированную аккумуляцию ионов кальция лейкоцитами. Как видно из рис. 8B после лазерного облучения суспензии ПМЛ в присутствии 0,1 мМ верапамила изменений концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток не происходило. Аналогичные результаты были получены Н. Коган и др. [41] при использовании другого блокатора потенциал-зависимых кальциевых каналов – нифедипина при исследовании лазер-индуцированной аккумуляции Са²⁺ сперматозоидами.

а) лазерное облучение в красном диапазоне спектра в присутствии экзогенных фотосенсибилизаторов инициирует ПОЛ мембран липосом [42], липопротеидов плазмы крови [43], мембран эритроцитов [44, 45];

б) инициация ПОЛ, накопление гидроперекисей в клеточных мембранах создаёт условия для увеличения ионной проницаемости и в том числе для ионов Са²⁺ через мембраны липосом [46], мембраны саркоплазматического ретикулума [47].

В связи с этим надо было выяснить, способно ли НИЛИ инициировать перекисное окисление липидов. С этой целью использовали модельные мембраны многослойных липосом, сформированных из суммарной фракции фосфолипидов желтка куриных яиц [48]. В качестве экзогенных фотосенсибилизаторов использовали производные гематопорфирина (ПГП, фотогем) и алюмофталоцианин (фотосенс). Суспензию липосом в присутствии фотосенсибилизатора и без него подвергали ЛО при постоянном перемешивании. Эффективность инициации фотосенсибилизированных СРР пероксидации мембран липосом оценивали с помощью двух методов:

А) определения концентрации вторичных продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, ТБК-реактивные продукты (ТБК-РП) [49], и

Б) измерения кинетики Fe²⁺-индуцированной хемилюминесценции [50]. (Результаты получены совместно с к.б.н. Т.В. Чичук и к.б.н. О.Б. Любицким.)

Было обнаружено (рис. 10, кривая 1), что с увеличением дозы ЛО суспензии липосом в присутвии ПГП происходило усиление ПОЛ, которое проявлялось в возрастании количества ТБК-РП. ЛО суспензии липосом без фотосенсибилизатора либо фотосенсибилизатора без липосом не сопровождалось образованием продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (рис. 10, кривые 2 и 3).

[На следующую часть] [На Список литературы]

Copyright ©