[На предыдущую часть]

Вторым способом оценки фотосенсибилизированной инициации ПОЛ было измерение кинетики хемилюминесценции [50]. Этот метод позволяет определить не только количество продуктов окисления липидов, но и в какой-то мере механизм инициации. Хорошо известно, что введение в систему структурированных липидов (мембраны или липопротеиды) ионов двухвалентного железа вызывает развитие характерной кинетики хемилюминесценции, на которой можно выделить несколько стадий: быстрая вспышка, латентный период и медленное свечение (рис. 11А).

Ранее в работах Ю.А. Владимирова было показано, что интенсивность быстрой вспышки (h) при определённых условиях пропорциональна концентрации так называемых предсуществующих гидроперекисей, ROOH, которые образовались в системе по ряду причин до введения Fe²⁺ [50]. В процессе работы было обнаружено (рис. 11Б), что ЛО суспензии липосом в дозе 7,64 Дж/см² приводило к увеличению интенсивности быстрой вспышки пропорционально концентрации введённого в суспензию фотосенса, что свидетельствует об увеличении в процессе облучения содержания в мембранах липосом гидроперекисей.

В нашей работе для преодоления этих трудностей мы использовали спектрофлуориметрический метод определения продуктов ПОЛ, в частности малонового диальдегида (МДА). Этот метод обладает значительно большей чувствительностью по сравнению со спектрофотометрическим методом определения МДА. Кроме этого, мы применили приём, обеспечивающий увеличение выхода МДА, как продукта разрушения накопившихся в процессе ЛО гидроперекисей ионами Fe²⁺ [49].

Для увеличения выхода вторичных продуктов окисления липидов к образцам суспензии клеток после лазерного облучения добавляли раствор двухвалентного железа в конечной концентрации 20 мкМ, разрушающего накопившиеся в процессе лазерного облучения гидроперекиси [44].

В работе показано, что (рис. 12А, кривая 1) при ЛО суспензии ПМЛ в дозе 3,2 Дж/см² и различной концентрации фотосенса происходит небольшое накопление МДА, которое значительно увеличивается после введения в суспензию облученных лейкоцитов раствора FeSO_4× 7H₂O (рис. 12А, кривая 2). Результаты вычитания данных, представленных кривой 2 и кривой 1 на рис. 12А, представлены на рис. 12Б и характеризуют в определённой степени уровень накопления липидных гидроперекисей в мембранах ПМЛ при ЛО.

Аналогичные по характеру результаты были получены и при ЛО суспензии ПМЛ без экзогенного фотосенсибилизатора (таблица) Видно, что ЛО суспензии ПМЛ приводит к увеличению образования МДА при последующем введении Fe²⁺ с достижением максимального количества МДА при дозе 2,0 Дж/см², равного 1,47 нмоль/10⁷ клеток.

Важно было выяснить, какова связь между накоплением продуктов ПОЛ в мембранах лейкоцитов и формированием лазер-индуцированного прайминга одних и тех же ПМЛ, выделенных из крови одного и того же донора. В таблице представлены значения индекса прайминга лейкоцитов, равные отношению I/I₀, где I – ХЛ-ответ ПМЛ после ЛО, а I₀ – ХЛ-ответ ПМЛ до облучения. Оказалось, что по мере увеличения дозы ЛО количество продуктов ПОЛ клеток возрастает. Так, при дозе 0,3 Дж/см² количество МДА составило 0,016 нмолей/10⁷ клеток, при дозе 1 Дж/см² – 0,278 нмолей/10⁷ клеток, а при дозе ЛО 1,5 Дж/см² – 1,292 нмолей/10⁷ клеток, в то время как величина индекса прайминга ПМЛ была максимальной при дозе 1 Дж/см² и составила около 280%, а при дальнейшем увеличении дозы ЛО – уменьшилась. Можно заключить, что ЛО суспензии лейкоцитов приводило к дозо-зависимому увеличению накопления продуктов ПОЛ, в то время как величина лазер-индуцированного прайминга ПМЛ увеличивалась, проходя через максимум с последующим ингибированием. Это может означать, что формирование фотосенсибилизированного прайминга фагоцитов зависит не только от общего количества продуктов перекисного окисления липидов в мембранах клеток, но и от качественного состава продуктов пероксидации. Наиболее важными в контексте рассматриваемого явления компонентами в смеси образующихся продуктов могут быть гидроперекиси липидов, способные, образуясь в мембранах или встраиваясь в мембраны, увеличивать их ионную проницаемость, в том числе и для ионов кальция [46, 47], что является необходимым этапом в процессе формирования прайминга лейкоцитов.

Имеется небольшое количество работ, в которых показано, что в результате лазерного облучения в красном и ближнем инфракрасном диапазонах спектра макрофагов [51, 52], лимфоцитов [24], фибробластов [25], сперматозоидов [41], клеток глии [53], митохондрий и везикул, сформированных из плазматических мембран сперматозоидов [54], происходило дозо-зависимое увеличение концентрации ионов кальция во внутреннем объёме везикулярных структур. Что же касается механизма лазер-индуцированного увеличения концентрации ионов кальция, то согласно концепции, разрабатываемой в нашей стране Т.Й. Кару [13], а в Израиле группой Р. Любарт и Г. Фридмана [54], основной причиной аккумуляции Са²⁺ является активация ферментов дыхательной цепи митохондрий, последующее за этим увеличение трансмембранного потенциала и потенциал-зависимое накопление ионов кальция в митохондриях клеток. Для объяснения лазер-индуцированной аккумуляции ионов кальция везикулами, сформированными из плазматических мембран сперматозоидов, не содержащих митохондрий, привлекается умозрительная гипотеза о возможности поглощения квантов ЛО молекулами Са²⁺-АТФазы [25].

Оставив в стороне вопрос о механизме лазер-индуцированного изменения активности ферментов дыхательной цепи митохондрий и фотомодификации Са²⁺-АТФазы, можно согласиться с авторами этой концепции о том, что ЛО клеток, содержащих митохондрии, может приводить к аккумуляции ионов кальция. В нашей работе в качестве объекта исследования использовались нейтрофилы крови, потребление кислорода которыми обусловлено не дыханием митохондрий, а активацией NADPH-азы . Следует указать, что созревшие гранулоциты содержат лишь несколько митохондрий на клетку и что потребляемый ими кислород необходим для осуществления эффекторных функций [55]. Остальные функции ПМЛ могут проявлять и в отсутствии кислорода, за счёт энергии анаэробного гликолиза [55]. Из этого можно предположить, что лазер-индуцированное изменение концентрации ионов кальция в цитоплазме ПМЛ не может определяться вкладом митохондрий или по крайне мере этот вклад является небольшим.

Согласно нашим представлениям, взаимодействие эндогенных и/или экзогенных фотосенсибилизаторов с квантами световой энергии приводит к инициации ПОЛ мембран лейкоцитов (рис. 12, таблица) с предпочтительным образованием в липидной фазе гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов [56]. Однако данные литературы и результаты наших предыдущих исследований свидетельствуют о том, что инициация ПОЛ модельных и клеточных мембран приводит к увеличению пассивного транспорта ионов кальция из внешней среды , где его концентрация на 3–4 порядка больше концентрации в цитозоле клеток. Увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция активирует Са²⁺-зависимые реакции, приводящие к формированию так называемого кратковременного прайминга лейкоцитов, который проявляется в сборке мембраносвязанной NADPH-оксидазы и экспрессии поверхностных рецепторов. Всё это вместе взятое, приводит к увеличению функционального потенциала фагоцитов, который проявляется при последующей стимуляции фагоцитов большей продукцией активных форм кислорода, гипохлорита и других прооксидантов, обусловливающей рост бактерицидности и цитотоксичности фагоцитов.

Что же касается пролонгированного прайминга лейкоцитов, то, как указывалось ранее, его формирование взаимосвязано с активацией синтетических процессов, поскольку он отменялся в присутствии ингибиторов синтеза белков: циклогексемидла и пуромицина [35] Это может иметь прямое отношение к лазер-индуцированной регуляции микроциркуляции крови, которая может осуществляться в какой-то мере за счёт действия оксида азота (NO), являющегося предшественником фактора, расслабляющего эндотелий сосудов (EDRF) [57]. Дело в том, что NO является продуктом функционирования специфического фермента NO-синтазы (NOS), который катализирует реакцию окисления аргинина до цитрулина и оксида азота. NOS в организме человека и животных присутствует по крайней мере в двух изоформах: конституционной (с NOS), присутствующей в клетках эндотелия, фибробластах, клетках глии и др. с момента их образования, и так называемой индуцибельной (iNOS). В исходных не активированных лейкоцитах NOS отсутствует; она появляется, индуцируется в процессе дополнительной стимуляции лейкоцитов. Механизм подобной стимуляции, приводящей к образованию индуцибельной NOS, в последнее время привлекает к себе большое внимание и в общих чертах он расшифрован (рис. 13) [58]. Оказалось, что для того, чтобы запустить синтез белков, и в том числе NOS, в лейкоцитах должно образоваться некоторое количество цитозольного дипептида, так называемого NF-kВ (ядерный фактор, белок группы к, впервые найденный в b-лимфоцитах) В исходных клетках этот фактор присутствует в неактивном состоянии в виде тримера, состоящего из двух пептидов самого фактора и третьего пептида, который является его ингибитором. При действии любого индуктора синтеза белка в лейкоцитах, в клетке образуется небольшое количество АФК, в частности Н₂О₂, которое индуцируют, с помощью внутриклеточных протеаз, диссоциацию исходного тримера в димер с выходом из комплекса ингибитора (IkВ) и переводом NF-kВ в активное состояние. При этом NF-kВ диффундирует из цитозоля в ядро, активирует ген, запускает транскрипцию с образованием соотвествующих m-РНК, которые затем выходят в цитоплазму, и на рибосомах запускается синтез соответствующих белков: iNOS, СОД, каталазы, цитокинов и др. Иными словами, первичной стадией запуска синтеза белков в лейкоцитах является внутриклеточное образование небольшого (микромоли) количества АФК. Следовательно, можно предположить, что (рис. 13) за счёт инициации фотосенсибилизированных СРР с участием эндогенных порфиринов в клетке может образовываться некоторое количество АФК, которые затем, воздействуя на NF-kB, запускают синтез белков, включая iNOS и различные цитокины. Вместе с тем, следует указать, что продукция лейкоцитами NO идёт на фоне образования супероксид-анион-радикала. О₂^– и NO способны к взаимодействию друг с другом в реакции с константой скорости, в несколько раз превышающей константу скорости реакции дисмутации супероксид-анион-радикалов в присутствии СОД. В процессе этой реакции образуется пероксинитрит ONOO^–, обладающий способностью к инициации свободнорадикальных реакций, вазоконстрикции, агрегации и адгезии лейкоцитов, т.е. к ухудшению микроциркуляции крови. Образование пероксинитрита находится под контролем продукции лейкоцитами супероксид-анион-радикала кислорода. Поэтому известная из литературы активация СОД, наблюдаемая в острой фазе воспалительных заболеваний и при ЛО [10, 14], за счёт элиминации О₂^– может способствовать увеличению выхода NO и превалированию вазодилятации над вазоконстрикцией микрососудов.

[На Список литературы]

Copyright ©